Evaluarea si cartarea diversitatii genetice a speciilor de stejari autohtoni din Romania in scopul gestionarii durabile a ecosistemelor forestiere si conservarea dinamica a resurselor genetice



Etapa II: Identificarea structurii genetice inter- si intra- populationale

in cadrul ecosistemelor naturale si artificiale de stejari


OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUTIE II
In cadrul primei etape de executie a proiectului au fost stabilite urmatoarele obiective, care reprezinta si principalele activitati ale etapei:
1 Descrierea ecosistemelor forestiere naturale si artificiale de stejari care au fost studiate
2 Evaluarea variabilitatii genetice intra- si inter- populationale in padurile naturale si artificiale
3 Crearea bancii de ADN si a bazei de date informatice in sistem GIS
4 Actualizarea paginii web a proiectului

In cadrul etapei a II a proiectului au fost descrise ecosistemele forestiere naturale si artificiale de cvercinee din care s-au recoltat probe in vederea realizarii studiilor privind diversitatea genetica si au fost caracterizata variabilitatea genetica a aceste ecosisteme.
Primele aspecte privind metodologia de cercetare au fost discutate cu toti partenerii implicati in proiect, metodologia fiind stabilita in urma intalnirii de la Cluj din perioada 7-8 Noiembrie 2007.
Deoarece metodologia cercetarii din domeniul geneticii moleculare cuprinde numeroase metode si tehnici de laborator, acestea au fost stabilite si descrise detaliat, in vederea corelarii rezultatelor finale.
A fost realizata o baza de date complexa prin extragerea din cadrul bazei de date amenajistice a tuturor informatiilor legate de speciile de stejari din Romania. Au fost identificate in baza de date urmatoarele specii: gorunul, in aceasta categorie fiind incluse cele trei specii, stejarul, stejarul brumariu, stejarul pufos si garnita. Nu a putut identificat Q. virgiliana, aceasta specie fiind inclusa in grupa stejarului pufos.
Informatiile obtinute din baza de date amenajistica sunt deosebit de complexe, cuprinzand urmatoarele caracteristici complexe ale arboretelor:
Au fost recoltate probe de la 1492 de exempare, din 208 de populatii de cvercinee dintre care 97 de gorun, 58 de stejar, 31 de garnita, 13 de stejar brumariu, 7 de stejar pufos si doua de cer.
Au fost identificate 10 haplotipuri cloroplastice, structura genetica a provenientelor fiind caracterizata de unu, doua si uneori chiar trei haplotipuri. Dintre haplotipurile descries 7, iar trei sunt haplotipuri noi care trebuie descries si dupa ce vor fi supuse unor noi teste de laborator.
De asemenea s-a constatat ca in zonele cu intense activitati forestiere, cresterea numarului haplotipurilor este mai mare si nu in putine cazuri apar haplotipuri nespecifice zonei analizate. Astfel au fost identificate populatii in care influenta factorului antropic este foarte pregnanta, structura genetica a populatiilor fiind modifica.
Referitor la rezultatele obtinute din analiza populatiilor de cvercinee din zonele cu fragmentare mare a fondului forestier, respective in populatiile create artificial prin plantatii, s-au constat cateva neconcordante referitoare la prezenta unor haplotipuri care nu sunt specifice zonelor analizate. Aceste neconcordante se refera in special la zona de sud a tarii.

REZULTATE
Distributia diversitatii genetic a stejarilor in populatiile analizate
Variabilitatea genetica a stejarului, in urma analizelor ADNcp, in cazul celor 128 de populatii si 641 de exemplare studiate este relativ ridicata. Dintr-un numar total de 10 haplotipuri cloroplasice identificate in studiile anterioare privind diversitate genetica a stejarilor la nivel European, realizat in 72 de populatii de cvercinee din Romania, in populatiile analizate in cadrul proiectului au fost identificate 7 haplotipuri cloroplastice commune si mai multe haplotipuri noi, ceea ce arata o diversitate genetica ridicata.
Reprezentarea pozitionarii haplotipurilor la nivel national si proportia acestora in cadrul culturilor comparative este redata in Anexa II.
Studiile anterioare (Petit R.J., et all 2002a,b ; Ferris et al. (1998) au aratat ca distributia haplotipurilor cloroplastice la cvercinee este specifica anumitor zone geografice. Din aceste considerente analizarea distributiei haplotipurilor s-a realizat pe zone geografice distincte.

Distributia haplotipurilor
Haplotipul 4 este raspandit din zona de sud vest a tarii (Calafat) si pana in centrul Podisului Moldovei (Bacau), insa este preponderant in regiunea Bucuresti si Buzau. Acest tip genetic a fost identificat in 20 de populatii (100 e exemplare) in majoritatea acestora fiind haplotipul dominant.
Acest haplotip a mai fost descris in zona de sud a tarii in studii anterioare, insa nu apare deloc in zona intracarpatica cu toate ca la nivel european este frecvent prezent in zona Europei Centrale si de Vest (Ungaria, Slovacia, Polonia si Germania).
Haplotipul 5 a fost frecvent identificat in populatiile din sud vestul tarii, fiind dominant in zona Mehedinti, Targu Jiu si chiar in anumite populatii din Dolj. Sporadic acest haplotip este intalnit in populatiile din zona Slobozia si Buzau, unde a fost identificat ca haplotip unic. De asemenea haplotipul 5 este caracteristic populatiilor din Campina, zona in care nu a mai fost identificat decat haplotipul 6, care apartine aceleasi familii, avand origine posglaciara comuna.
Este cel putin curioasa aparitia acestui haplotip in zona de sud a tarii, acesta avand origine postglaciara in Peninsula Italica, iar in studiile anterioare nu a fost identificat decat in zonele cu influente antropice evidente. Din aceste considerente aparitia sa in zonele din Slobozia si Buzau se datoreaza cel mai probabil transferului de material semincier. Este posibil ca acest transfer sa se efectuat cu o intensitate mare si in zona Campina, insa cel mai probabil aparitia acestuia se datoreaza recolonizarii postglaciare, realizata dinspre zona intracarpatica, pe valea Prahovei in directia Bucuresti.
Haplotipul 6 este semnalat atat in zona intracarpatica, cat si cea extracarpatica, in 13 populatii si la 53 de exemplare. Daca aparitia acestuia in zona Campina poate fi pusa pe seama recolonizarii postglaciare alaturi de haplotipul 5, prezenta sa in zona Dolj-Valcea se poate datora transferului antropic de material genetic. Ca si haplotipul anterior are originea in Peninsula Italica, in studiile anterioare fiind localizat preponderent in estul Transilvaniei.
Haplotipul 13 are frecventa cea mai redusa dintre haplotipurile identificate pana in present fiind identificat in 7 populatii la 27 de exemplare. Este localizat preponderent in sudvestul tarii (Dolj, Mehedinti). Este un haplotip specific zonei Balcanice, fiind detectat si descris pentru prima data in Romania. Este specific zonei de sud si est a tarii reprezentand cu siguranta un haplotiv autohton valoros. Surprinzator este faptul ca pana in present nu a fost idntificat in nici o populatie analizata din Moldova.
Haplotipul 15 (15-17) este foarte raspandit haplotip din zona de sud, fiind intalnit sporadic si in populatiile din est, de regula impreuna cu alt haplotip (H4 si H16). A fost descries in 33 de populatii, la 91 de exemplare, reprezentand cca 20% din populatiile analizate. Acest haplotip este de origine balcanica, in studiile anterioare fiind descries doar in populatiile de stejari extracarpatice.
Haplotipul 16 este cel mai raspandit haplotip din zona de sud si est a tarii si a fost descries in 33 de populatii, la 116 exemplare. Este cel mai adesea insotit in aceasi populatie de haplotipul 15, iar in zona Buzau de haplotipul 4. Reprezinta unu din cele mai valoroae haplotipuri locale, fiind identificat pentru prima data in Romania si este specific zonei Balcanice si Europei de Est.
Haplotipul 30 este prezent doar in 8 populatii si la 45 de exemplare, avand un areal discontinuu. Caracterizeaza bine zona de sud a judetului Dolj (Calafat, Segarcea), insa este identificat si in zona Slobozia, Bucuresti si Bacau. Dupa modul de distributie al haplotipului se pare ca acesta caracterizeaza populatiile din zonele de silvostepa. Acest haplotip a fost identificat pana in prezent doar in populatiile de stejari din Romania, prin unicitatea sa constituind un haplotip este deosebit de valoros in padurile de cvercinee, contribuind la asigurarea structuri specifice a biodiversitati din zona de sud.
Haplotipul 01 include toate haplotipurile noi identificate ca urmare a analizelor de laborator realizate in cadrul temei. Ele nu au fost definite ca haplotipuri distincte deoarece identificare acestora se va realiza doar dupa repetarea tuturor fazelor de extractie, amplificate si evaluare a polimorfismului. Cele 8 populatii in care au fost identificate noile haplotipuri sunt situate majoritar in sudul tarii, proportia haplotip in structura populatiei fiind variabila.

Concluzii privind variabilitatea genetica a cvercineelor

Analizand rezultatele obtinute din analiza celor 169 de populatii de cvercinee si 641 de exemplare se poate observa usor numarul mare de haplotipuri cloroplastice identificate in cadrul acestei etape.
Au fost identificate 10 haplotipuri cloroplastice, structura genetica a provenientelor fiind caracterizata de unu, doua si uneori chiar trei haplotipuri. Dintre haplotipurile descries 7, iar trei sunt haplotipuri noi care trebuie descries si dupa ce vor fi supuse unor noi teste de laborator.
Studiile paleobotanice si genetice realizate la nivel european identifica doar trei refugii glaciare majore pentru cvercinee: Peninsula Italica, Peninsula Balcanica si Peninsula Iberica. Recolonizarea postglaciara a teritoriului Romaniei s-a realizat cu proveniente din primele doua refugii glaciare. Au fost identificate haplotipuri si familii de haplotipuri specifice zonelor geografice amintite mai sus.
De asemenea s-a constatat ca in zonele cu intense activitati forestiere, cresterea numarului haplotipurilor este mai mare si nu in putine cazuri apar haplotipuri nespecifice zonei analizate. Astfel au fost identificate populatii in care influenta factorului antropic este foarte pregnanta, structura genetica a populatiilor fiind modifica.
Referitor la rezultatele obtinute din analiza populatiilor de cvercinee din zonele cu fragmentare mare a fondului forestier, respective in populatiile create artificial prin plantatii, s-au constat cateva neconcordante referitoare la prezenta unor haplotipuri care nu sunt specifice zonelor analizate. Aceste neconcordante se refera in special la zona de sud a tarii.
Daca aparitia haplotipului H5 in apropierea Bucuresti-Campina si Gorj-Mehedinti a mai fost detectata, chiar daca nu cu aceeasi intensitate, si este rezultatul unor transferuri genetice antropice specifice zonelor forestiere indelung antropizate, nu aceeasi situatie este in cazul prezentei acestui haplotip in zona Slobozia - Bucuresti.
De asemenea detectarea haplotipului H6 in proportii atat de ridicate in zona de sud-vest (Gorj), ridica mai multe semne de intrebare asupra certitudinii provenientelor materialului semincer utilizat realizarea plantatiilor.
Avand in vedere pozitia geografica a Romaniei, fata de refugiul postglaciar din Balcani, variabilitatea genetica a stejarilor din zona de sud a tarii este ridicata, iar aparitia haplotipurilor cu originea postglaciara in Peninsula Italica trebuie atent verificata, iar in masura in care aceasta este rezultatul activitatilor de transfer genetic, populatiile afectate vor trebui clar identificat si cartografiate.

Crearea bancii de ADN si a bazei de date informatice in sistem GIS
Toate probele biologice, constand in muguri sau frunze, au fost codificate utilizand sistemul informatic privind ecosistemele forestiete din Rominia. Dupa extragerea ADN acestea au fost introduse pentru conservarea pe termen lung intr-un congelator la -80OC, realizandu-se astfel baza bancii de ADN. Tot materialul ce va fi colectat in cadrul proiectului va fi astfel conservat si va contribui la marirea bancii de ADN.
Baza de date privind caracteristicile ecologice a populatiilor de cvercinee studiate a fost indexata cu noi date privind diversitatea si structura genetica rezultand un system informatic complex. Acest sistem este creat in sistem GIS, utilizandu-se programul ARCGIS 9.2 .